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流式细胞术在临床医学的应用


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流式细胞仪在医学检验中的应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗行定量分析和分选 的检测手段,具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点,是目前先进的细胞定 量分析技术之一。 近年来,FCM 的发展日新月异,技术不断有新的突破,新型仪器不断涌现,同时,FCM 在医学及其他科学的应用更加广泛和深入, 涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面, 涉及 免疫学、血液学、肿瘤学等。

图 1. 流式细胞术工作原理图

一、流式细胞术的研究进展 1. 流式细胞仪的进展 近年来, 随着将多种不同波长的新型激光器与新型荧光染料的新型染色剂相结合, 流式 细胞仪性能不断提升,体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升,以及激光通道和参 数的增多。此外,流式细胞仪不断打破传统的界限,实现了多学科的交叉发展,诞生了一些 新理念、新技术融合的仪器。例如,微流控芯片流式 细胞仪,是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪, 具有结构简单、 操作方便、 体积小、 价格低廉等特点; 声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦 于流动室的中轴上,代替传统的流体动力,实现高通 量、高精确度分析;质谱流式细胞仪将传统流式细胞 仪与质谱分析技术相结合, 采用同位素标记特异性抗 体, 利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技 术, 可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重 叠、影响分辨的问题;将传统的流式细胞仪的荧光信 号与荧光显微镜的形态学结合, 形成了成像流式细胞仪, 检测者可以目睹到每个细胞或颗粒 的形态。质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪。

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2. 流式细胞术的进展 FCM 主要用于分析荧光标记的细胞和颗粒,也是目前广泛的应用领域。但是,新近研 究打破了这一界限, 实现了流式细胞仪由检测荧光标记的细胞, 到可以检测无需荧光标记细 胞的飞跃,这种技术对细胞无损坏、避免了荧光染料的干扰,将进一步提升 FCM 的应用范 围和价值。 有学者研究出一种新的 FCM, 称为实时变形性流式细胞术(real-time deformability cytometry,RT-DC),利用肿瘤细胞等细胞的内在特性——变形能力,对无标记的目标细胞 分析,这种无标记的分析方法为流式细胞分析增加了新的可能。 3. 流式细胞术应用进展 FCM 是一种重要的技术,具有许多应用,可用于许多疾病状态的诊断和分类,特别是 造血系统癌症。随着时间的推移,FCM 应用范围也在不断扩大,新的一些临床检测和科研 项目也在不断开发。 3.1 流式细胞术在原发性免疫缺陷病诊断中的应用 原发性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease,PID)是由于遗传因素或先天性 免疫发育不良造成的免疫功能障碍所致的疾病。目前,PID 的发病率在我国以及亚洲属于前 列,研究表明,很多免疫缺陷病经过临床和精准的诊断(包括基因诊断、蛋白质水平诊断和 功能水平诊断)之后都可以进行很明确的诊断, 但如果没有及时发现, 患儿很容易发生严重的并 发症威胁生命。 FCM 是一种对单细胞或其他生物粒子进行 定量分析和分选的手段,具有速度快、精度高、 准确性好等优点, 已经成为了当代最先进的细胞 定量分析技术,可以直接评估免疫细胞和分子。 洛杉矶儿童医院的实验室主任 Maurice R. O'Gorman 教授,利用流式细胞技术进行了几项 儿童原发性免疫缺陷病筛查试验, 成功的开发了 一种多色流式细胞术,该方法可以在不到两个小时的时间内在 6 至 10 个颜色检测系统的单 管中对全血进行常规免疫分型。 该方法可以在标准临床实验室对与儿童原发性免疫缺陷病有 关的免疫异常进行快速准确的诊断和预后监测。 National Jewish Health 免疫学家 Vijaya Knight 博士,他通过 FCM 检测自身抗体,成功 分析了分枝杆菌感染引起的免疫缺陷病。 同时, 由于自身抗体能被免疫系统中的细胞因子中 和,自身抗体的检测开辟了新的治疗可能性,例如用免疫调节剂(例如,与抗细菌药物偶联 的 T 细胞消耗剂)治疗患者。 与传统的基因序列分析相比较,FCM 是基于单个细胞上的检测,可以评价单个细胞的 特性,分析细胞的类型,检测待定基因产物,是一种快速、灵敏重、复性好的分析方法。随 着对 PID 发病机制的深入了解及新抗原抗体的不断发现,不远的将来,FCM 诊断试验将发 生更大的作用。 3.2 流式细胞术在癌症检测中的应用 随着科技的进步与发展,FCM 的出现使肿 瘤治疗有了质的飞跃。 其应用主要是通过测 DNA 含量实现的,包括癌前病变检查、早期癌变的检 出、化疗指导以及预后评估等。 利用 FCM 进行细胞周期分析、 DNA 倍体分

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析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡 等, 从而获得组织形态学方法难以得到的信息, 可为肿瘤的临床诊断、 治疗和预防提供帮助。 对肿瘤细胞 DNA 含量作定量分析,解析细胞周期,通过细胞异倍体测定预测各种肿瘤的预 后,并能在化疗中对药物的选择和放疗中强度、时间的决定等起指导作用。解析抗癌药物作 用机制,对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定参考价值。此外,由于 FCM 对凋亡、周 期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也发挥着重要作用,近年来引起肿瘤研究者的极大关注, FCM 已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中,为肿瘤诊断、疗效评价和预后预测提供重要参 考指标。另外,传统的细胞形态学至今仍是诊断肿瘤的一种重要的手段。多年来,细胞学工 作者就设想使肿瘤细胞学诊断自动化, 流式细胞术的问世, 使细胞学检查自动化的宿愿如愿 以偿,并已广泛应用于肿瘤临床细胞学的诊断研究。 大量的临床应用表明, 流式细胞术对肿瘤细胞学的诊断正确率已达常规细胞学诊断水平。 肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。 肿瘤细胞的耐药性可分为原发耐药和 继发耐药, 前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中, 与用药无关, 后者是由化疗药物诱导产生的, 即在药物使用前对药物敏感, 而在用药之后产生耐药。 继发耐药根据耐药谱的不同又可分为 原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)。MDR 相关蛋白包括 P 糖蛋白、多药耐药相关蛋白等。 它们都属于 ATP 酶活性转运蛋白,均是通过药物外排泵的作用降低细胞中药物的聚集。因 此应用 FCM 检测肿瘤细胞的多药耐药相关蛋白的表达水平, 对监测临床肿瘤化疗效果及药 物的选择有一定意义。 此外,FCM 在检测微小残留病(minimal residual disease, MRD)具有独到优势。虽然实 时荧光定量 PCR 技术(real-time PCR, Q-PCR)是目前灵敏度最高的 MRD 检测方法,但对 于多数无分子生物学异常的白血病患者来说,由于 PCR 产物与白血病细胞数目没有确定的 比例,无法对残存的白血病细胞做出精确的评估。况且,白血病的异常分子标记也具有一定 的不稳定性,这也为 PCR 检测 MRD 带来了困难。因此,FCM 通过对 MRC 的白血病相关 免疫表型(leukemia-associated immunopheno, LAIP)检测,比 Q-PCR 技术更直观的对残留 白血病细胞进行准确定量,且敏感度也可达到 10-4 甚至 10-5,成为检测 MRD 最有前景的一 种方法。 二、展望 精准医疗的时代已经到来,疾病的精确诊断是精确治疗的关键。新的时代背景下,分子 诊断技术如雨后春笋般涌现, 利用各种基因检测技术和荧光定量原位杂交技术, 以及一些高 通量测序技术对肿瘤分子分型诊断和治疗左键成为趋势。FCM 凭借其独特的检测原理和强 大的荧光抗体技术仍将在肿瘤的早期诊断中发挥不可替代的作用,未来 FCM 将与组织学诊 断,分子诊断等完整的结合在一起,给临床提供一个更准确,更完整的疾病诊断报告。


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